Polysciences 24765-1试剂

一、贴壁细胞转染：Polysciences 24765-1试剂

以293T细胞为例，需要精确控制转染条件以确保*高效率。以下是具体步骤：

细胞准备：

使用胶原酶处理细胞并计数。在6孔板中以每孔2×106细胞接种。每孔加入2 mL新鲜的DMEM/F12+5%FBS 培养基和1 mL的细胞悬液，置于37℃，5%CO2培养箱培养24 h。24 h后,移除之前培养基，每孔加入2 mL新鲜的DMEM/F12+5%FBS。

转染过程：

1.检查细胞汇合度，达到70%-80%时开始转染。

2.分别用两份100 µL无血清培养基稀释DNA，使DNA终浓度为1 µg/ml（DNA/总培养体积）和适当比例的适量Polysciences 24765-1。DNA:PEI 的比例要依据自己实验摸索最适比例。

3.将稀释的Polysciences 24765-1转染试剂与质粒（总体积200 µL）轻轻混匀，室温孵育30 分钟。

4.PEI-DNA 复合物滴加到细胞培养板每个孔中，轻摇混匀。注意轻轻沿着孔板边缘滴入，以免破坏细胞的粘附性。

5.将培养板放入37℃，5%CO2培养箱培养中培养24 h。

结果观察：

在24小时后使用荧光显微镜观察转染效果，超过80%的293T 细胞在转染后的24 h可以观察到绿色荧光。

二、悬浮细胞转染：Polysciences 24765-1试剂

悬浮细胞转染步骤略有不同，小规模转染时，用新鲜的培养基重悬浮，使细胞密度达到 1×106cells/mL，如需大规模转染细胞密度要到达2-3×106cellsml/mL。

以293F细胞为例：

细胞准备：

传代接种于20 mL 悬浮细胞生长培养基中(36.5℃，120 rpm，5%CO2 )培养细胞至1×106 cells/mL的密度，旋紧瓶口放入摇床，2~4 小时后可以进行转染。

转染过程：

1.用1 mL无血清培养基稀释适量的DNA，使DNA 终浓度为1 µg/ml，混匀并静置5 min。

2.用1 mLOptiPRO

SFM(无血清培养基)稀释适当比例的PEI 40000，混匀并静置10 min。

3.将稀释的24765-1转染试剂与质粒轻轻混匀，室温孵育30分钟。

4.将PEI-DNA 转染复合物逐滴加入到细胞培养液中，摇匀后旋紧瓶口放回摇床（36.5℃，5%CO2，120 rpm）。

5.基因表达可在24-72小时后检测，时间取决于细胞系和转基因。