产品详情
PCR的反应条件:
因扩增片段的大小、反应体积、使用扩增仪器的不同而不同。
◇ 循环次数
根据模板DNA的量以及扩增片段的大小,设定25~30个循环。
如果循环次数太少,扩增量不足;如果循环次数太多,则会出现Smear。
◇ Anneal以及Extension
合适的Anneal温度通常在45~68℃之间 (预备实验可2℃间隔进行)。另外,由于在60~68℃间,也有很高的活性, 因此可在此温度范围内设定Anneal-Extension温度, 进行2 Step PCR。Anneal-Extension温度为68℃ 时,每kbp大体可设定30秒~1分钟;当温度设定在68℃以下时, 时间设定可稍长一些。通常,Anneal温度太高,有时会得不到扩增产物;Anneal温度太低时,容易发生非特异性反应。另外,Extension时间太短时,会得不到扩增产物或者会有一些短的非特异性产物优成;而Extension时间太长时,会出现Smear。
参数规格:
产品名称:鸭种特异性基因核酸检测试剂盒
产品规格:50T
产品货号:FS-P10226
产品分类:荧光PCR法
产品运输:低温运输
储存条件:-20℃避光保存,避免反复冻融。
运输:低温、避光,快递免费送货上门。
产品特点:
本产品就是根据保守区设计引物而开发的高灵敏 PCR检测试剂盒 。
实验过程:
一、试剂准备
1. DNA模板
2.对应目的基因的特异引物(在PCR反应中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制,而不能从无到有,凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根据你的模板链设计。因此,扩增不同的基因需要设计不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步骤
1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。
2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,zui后在72℃ 保温7min。
3.结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4.PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μlLuFang进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。
定量PCR方法:
a、竞争法
选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中,待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增(其中一个引物为荧光标记)。扩增后用内切酶消化PCR产物,竞争性模板的产物被酶解为两个片段,而待测模板不被酶切,可通过电泳或高效液相将两种产物分开,分别测定荧光强度,根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
b、内参照法
在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物,内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记,下游引物不标记。在模板扩增的同时,内标也被扩增。在PCR产物中,由于内标与靶模板的长度不同,二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来,分别测定其荧光强度,以内标为对照定量待检测模板。
c、PCR-ELISA法
利用di高辛或生物su等标记引物,扩增产物被固相板上特异的探针所结合,再加入抗di高辛或生物su酶标抗体-辣根过氧化物酶结合物,最终酶使底物显色。常规的PCR-ELISA法只是定性实验,若加入内标,作出标准曲线,也可实现定量检测目的。
实时荧光定量PCR:
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果。因此,实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的:
1)Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确,重现性*定量方法,已得到的*,广泛用于基因表达研究、转基因研究,药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。
无乳链球菌 兰氏B群研究模式菌株: no病料提供形式: 冻干物安全等级: 2培养基: 396生长条件: 37
条纹拟盘多毛孢植物病原菌模式菌株: no散尾葵提供形式: 斜面培养物安全等级: 1培养基: 0014生长条件: 25-28℃
韩国假单胞菌大洋细菌模式菌株: no沉积物/深海沉积物提供形式: 冻干物安全等级: 1培养基: 471生长条件: 28℃
AS3.852产糖化酶。模式菌株: no种属: Rhizopus│japonicus提供形式: 斜面培养物安全等级: 1培养基: CM0014生长条件: 28℃
淡紫拟青霉生长条件: 25培养基: 14提供形式: 斜面培养物安全等级: 1模式菌株: no 定期移植法
苏云金芽孢杆菌生长条件: 30℃培养基: 0002提供形式: 冻干物安全等级: 1模式菌株: no 液氮超低温冻结法;真空冷冻干燥法
-135℃冰箱冻结;真空冷冻干燥
假诺卡氏菌培养基: 14模式菌株: no水中底泥提供形式: 斜面培养物;冻干物安全等级: 1生长条件: 25℃ -80℃冰箱冻结法;真空冷冻干燥法;矿物油法
毛柄金钱菌(金针菇)培养基: 0017食用菌提供形式: 斜面培养物安全等级: 1模式菌株: no生长条件: 25℃ 液氮超低温冻结法;真空冷冻干燥法
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YIM61420模式菌株: no安全等级: 1种属: Streptomyces│sp.植物提供形式: 冻干物培养基: 0038生长条件: 28℃
大肠埃希菌科研及血清定型模式菌株: no病料提供形式: 冻干物安全等级: 2培养基: 335生长条件: 37
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改良MC培养基250incubationmedia改良MC培养基250
营养琼脂 250g 霍乱弧菌传代培养或纯化培养
华伦斯坦实验室营养琼脂 WL Nutrient Agar 250克 啤酒和发酵产品中酵母菌和细菌的计数
沙氏脑心浸液琼脂 Sabouraud BHI Agar 250克 真菌检测
鸭种特异性基因核酸检测试剂盒
三糖铁管规格:5ml*20支/包用途:用于肠杆菌科细菌的生化反应筛选
T1N3 肉汤规格:250g用途:用于霍乱弧菌的生长试验(SN标准)
抗生素检定培养基1号(PH6.5-6.7)规格:250g用途:用于药品抗生素效价测定
TSA表面接触皿(6.5cm)规格:10个/包用途:用于环境、器皿、设备和表面的无菌检测