产品详情
哺乳动物组织与细胞原代培养操作步骤!
哺乳动物组织与细胞原代培养操作步骤!
一、实验器材
1.仪器
倒置显微镜,CO2培养箱,普通冰箱,超净工作台,低速冷冻离心机.显微数码摄影系统,孵蛋器。
2.材料与试剂
(1)非无菌材料酒精棉球,离心管架,*.记号笔。
(2)无菌材料和试剂 辅料镊,*,眼科*,一次性培养皿,6孔细胞培养板,15m1离心管,长丝滴管,10ml刻度移液管,0.25%*溶液.含500u/ml硫酸*的Hank’s液,10%Bs—DMEM培养液,lmol/L HCl溶液。
(3)组织细胞材料孵化10d的鸡胚蛋。
二、操作步骤
1.消化法培养——原代细胞培养
(1)取材取孵化lOd的鸡胚蛋,75%酒精棉球擦拭蛋壳.大头朝上平稳立放于离心管架上。用辅料镊剥开顶部的部分蛋壳,换一把*挑破血囊膜,小心取出鸡胚,放于无菌培养皿内,用*除去头部,然后用弯头眼科捏夹起腹部皮肤,剪开腹腔和胸前,去除内脏。
(2)漂洗和剪切将胚体用镊子夹取,用含500U/ml硫酸*的Hank’s液淋洗3遍以去除血污(含红细胞等血液细胞),转移到无菌培养皿内,用*剪成lmm3的小块。
(3)消化加入无菌O.25%*溶液使组织块浸没,放37℃培养箱保温10~20min,期间每3~5min观察、振摇1次,使组织松散。若观察到组织块显白色时,取到超净工作台内,无菌操作用长丝滴管反复吹打组织块。添加3~5ml*培养液,换一支长丝滴管反复吹打,将细胞悬液通过100目不锈钢筛网,收集到另一个无菌培养皿内·换另一支长丝滴管,收集细胞悬液到无菌15ml外螺旋盖离心管内。
(4)离心与计数1000r/min 6min离心,无菌操作下小心倾倒去除上清。然后用弹指法使沉淀松散,添加5~10ml*培养液,用长丝滴管小心混匀。用微量移液器取细胞悬液到计数板计数,每次2个计数窗的读数应接近,取平均值为本次读数的细胞密度,连续2次的读数相近时取均值代表该单细胞悬液的细胞密度。
(5)接种与培养 用*培养液调整细胞密度为1×105/ml,接种到6孔细胞培养板内,接种2孔。
标注组织细胞名称、班级组号、接种日期等信息。
静置后,在倒置显微镜下观察孔内细胞状况和形态,拍摄数码照片。放37℃5%CO2培养箱培养。
(6)观察记录和换液每天观察,针对有代表性的视场,拍摄数码照片。记录内容包括:观察时间(培养时间)、细胞形态、贴壁情形、染菌状况、培养液颜色。
在成纤维细胞形成单层以前.需要每3~4天更换一次新鲜培养液。形成细胞单层,汇合度接近90%时即终止培养,整理实验数据。
2.组织块培养——组织培养
(1)取材取孵化。lOd的鸡胚蛋,75%酒精棉球擦拭蛋壳,大头朝上平稳立放于离心管架上。用辅料镊剥开顶部的部分蛋壳,换一把*挑破血囊膜,小心取出鸡胚,放于无菌培养皿内,用*除去头部,然后用弯头眼科捏夹起腹部皮肤,剪开腹腔和胸前·去瞎内脏。
(2)漂洗和剪切 将胚体镊子夹取,用含500U/ml硫酸*的Hank’s液淋洗3童以去除血污(含红细胞等血液细胞),转移到无菌培养皿内,用*剪成1rrim。的小块。
(3)离心1000r/min离心6min,无菌操作下小心倾倒去除上清。然后用弹指法使瓶淀松散,添加5~10ml*培养液,用长丝滴管小心混匀。离心操作重复1次。
(4)接种与培养添加新鲜*培养液.使组织块浸没。用长丝滴管小心取组织块悬荐液,按3--5mm间隔排布组织块液滴,置于6孔细胞培养板内,接种2孔。小心操作,使每个小液滴仅含1个组织块,可用微量移液器移除多余液体。
标注组织细胞名称、班级组号、接种日期等信息。
针对有代表性的显微视场,拍摄数码照片。放37℃ 5%CO2培养箱静置培养。
(5)观察记录和换液培养16~24h,每孔添加新鲜*培养液2.5~3.0ml。逐天观察培养孔。针对有代表性的显微视场,拍摄数码照片。记录内容包括:观察时间(培养时间)、细胞形态、贴壁情形、染菌状况、培养液颜色。
在成纤维细胞形成单层以前,需要每3-4天更换一次新鲜培养液。形成细胞单层,汇合度接近90%时即终止培养,整理实验数据。
三、注意事项
1.自取材开始,保持所有组织细胞处于无菌条件,细胞计数可在有菌环境中进行。
2.75%酒精泡消毒的时间不宜过长,以免酒精从口和浸入鸡胚体内。
3.待到组织块周围长出单细胞层后将组织块剔除,便可收获细胞或进行传代培养。
4.*消化的时间长短与组织细胞的幼嫩程度、数量以及酶的活力等因素密切相关,另外在消化过程中应密切观察,及时吹打,避免消化过度。
北京百欧博伟生物技术有限公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务,对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位,都有相关人士进行维护,确保您在微生物菌种查询网中获得服务!也正因为此,北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系!
LOCA路可移动电源 高温高压式液位计 锯齿型高速分散机 lng船用大口径超低温液动截止阀 超声波手持应急气象站 普利赛斯 ATMLDF型分体式电磁流量计 6000kN材料试验机 奥特三目生物显微镜B204TR 卡箍式涡轮流量计 BUSSMANN熔断器 液化气分析仪 直流真空泵 PPMhtv型甲醛检测仪 氯气气体检测仪 气动胶管阀 隔膜抗震压力表 煤气换向阀 YB-150精密压力表 MilliporeElix纯水仪 ZSJRD-200A电子式热继电器校验台 Lab-Aid820核酸提取系统 HAST高度加速老化试验机 地下管道探测检漏仪 好凯德真空泵 卧式拉力机 薄壁件抛光机 JK系列耐磨热电阻 植物表型 基于光电式电流互感器的差动保护理论与实验研究 结晶器总成 油液污染度测试仪 TLHG-9905高压钳形漏电流表 扫频信号源 热保护开关 蒸气老化试验机 数据通信用ASM系列矩形连接器 制砖机液压站 工程宝HVT-2000 应急行业便携式气象仪 可程式恒温恒湿试验仪 真空校验仪 管线式高剪切乳化泵 QJNZ钢筋扭转试验机 二通内螺纹旋塞阀 螺纹式隔膜电接点压力表 饮用冷水水表和热水水表第1部分:计量要求和技术要求 管段式超声波热量表 万向坡度测量仪 手持危险液体探测仪